Ban đầu bà được phân công làm liên lạc, vận động quần chúng vào các "Hội cấy", "Hội cuốc", rải truyền đơn, tuyên truyền cách mạng trong giới nữ tại quê hương. Vào năm 1940, quê hương bà sau Khởi nghĩa Nam Kỳ bị dìm trong khủng bố, ông Ba Bích - chồng bà, bị giặc bắt, đày đi Côn Ðảo 5 năm rồi vĩnh viễn nằm lại tại Nghĩa trang Hàng Dương. Chẳng lâu sau, bà cũng bị giặc bắt giam tại nhà tù Bà Rá (tỉnh Bình Phước nay). Xa đứa con thơ mới bảy tháng tuổi, gửi lại con cho bà ngoại nuôi và phải chịu đựng mọi nhục hình tra tấn dã man của đế quốc, song bà vẫn một mực kiên trung bảo vệ Ðảng, bảo vệ cơ sở cách mạng. Năm 1943, do bị bệnh nặng trong tù và không có bằng chứng buộc tội, địch phải trả tự do cho bà.
Cách mạng Tháng Tám-1945, bà tham gia khởi nghĩa giành chính quyền ở Bến Tre. Tháng 4-1946, bà cùng đoàn đại biểu miền nam ra bắc gặp Trung ương Ðảng và Bác Hồ báo cáo tình hình Nam Bộ sau Hiệp định sơ bộ ngày 6-3-1945.
Năm 1960, bà là một thành viên trong Ban Chấp hành Ðảng bộ tỉnh Bến Tre chỉ đạo phong trào Ðồng Khởi và đã giành thắng lợi vẻ vang của đất xứ Dừa. Tại quê hương Lương Hòa của bà vinh dự mang tên làng Moncada, điểm khởi nghĩa đầu tiên của đất nước Cu-ba anh em. Sau đó, bà được giao trọng trách Bí thư Tỉnh ủy Bến Tre và là Ủy viên Ðoàn Chủ tịch Mặt trận Dân tộc Giải phóng miền Nam Việt Nam. Hình ảnh bà Ba Ðịnh với áo bà ba, khăn rằn, chiếc nón lá Nam Bộ, chiếc túi nhỏ đeo vai đã trở thành niềm tin yêu, cảm mến của quân, dân miền nam cũng như phụ nữ tham gia cách mạng trên cả nước.
Năm 1965, bà được cử làm Phó Tổng tư lệnh Lực lượng Võ trang Giải phóng miền Nam Việt Nam kiêm Chủ tịch Hội Liên hiệp Phụ nữ giải phóng miền Nam Việt Nam. Bà đã cùng Bộ Chỉ huy Quân sự chỉ đạo phong trào chiến tranh du kích ba mũi giáp công: chính trị, võ trang, binh vận, gây nên nhiều phong trào có ý nghĩa tại các đô thị miền nam, trong đó có Sài Gòn - Gia Ðịnh.
Bà là một trong những người đầu tiên vượt hiểm nguy và mọi sự kiểm soát gắt gao của Mỹ - ngụy Sài Gòn để cùng anh em cảm tử mở tuyến đường Hồ Chí Minh trên biển, nhằm đưa vũ khí, đạn dược tiếp viện cho phong trào đấu tranh ở Nam Bộ, dấy lên ngọn lửa Ðồng Khởi - Bến Tre và Ðồng Khởi - Nam Bộ anh hùng mà cả thế giới đều khâm phục.
Tại Lễ kỷ niệm lần thứ 20 ngày thành lập Hội Liên hiệp Phụ nữ Việt Nam ở Hà Nội, Bác Hồ đã đến dự và đánh giá, ngợi khen người phụ nữ Nam Bộ dáng nhỏ nhắn mà rất đỗi anh hùng. Bác đã nói tại lễ kỷ niệm, "Phó Tổng tư lệnh Quân giải phóng miền Nam là cô Nguyễn Thị Ðịnh. Cả thế giới chỉ nước ta có vị tướng quân gái như vậy. Thật là vẻ vang cho miền nam, cho cả dân tộc ta".
Năm 1974, bà Nguyễn Thị Ðịnh được phong quân hàm Thiếu tướng Quân đội nhân dân Việt Nam.
Sau ngày thống nhất đất nước, bà là Ủy viên Ban Chấp hành Trung ương Ðảng, Thứ trưởng Bộ Lao động - Thương binh và Xã hội.
Từ tháng 6-1980 đến năm 1992, là Chủ tịch Hội Liên hiệp Phụ nữ
Việt Nam (1982-1992), rồi Phó Chủ tịch Hội đồng Nhà nước, Chủ tịch Hội Hữu nghị đoàn kết Việt Nam - Cu-ba, Phó Chủ tịch Liên đoàn Phụ nữ dân chủ thế giới, Ủy viên Ðoàn Chủ tịch Ủy ban T.Ư Mặt trận Tổ quốc Việt Nam. Bà đã được tặng nhiều Huân chương cao quý và đã được Chủ tịch nước truy tặng danh hiệu Anh hùng Các lực lượng vũ trang nhân dân ngày 30-8-1995.
Nữ tướng Nguyễn Thị Ðịnh mất năm 1992.
