Thành lập ngày 10-10-1969, tiền thân của Nhà hát vốn là Đoàn Nghệ thuật Kim Đồng, trực thuộc Sở Văn hóa Thông tin Hà Nội, với nhiệm vụ chuyên biểu diễn rối cạn phục vụ thiếu nhi Thủ đô. Ban đầu, Nhà hát có trụ sở tại tầng hầm của Sở Văn hóa Thông tin Hà Nội, số 47 Hàng Dầu. Các buổi biểu diễn hầu hết là lưu động và miễn phí cho bà con. Các thiết bị, dụng cụ, con rối được vận chuyển bằng xe ba gác. Có những lúc sân khấu diễn rối là bể bơi Quân đội, thậm chí là nhà thủy đình của đền Ngọc Sơn.
Tiết mục "Tấm Cám" có sự tham gia của các thế hệ nghệ sĩ, diễn viên Nhà hát.
Ra đời trong thời kỳ chiến tranh chống Mỹ, các nghệ sĩ, diễn viên, cán bộ… của Đoàn phải đương đầu với vô vàn khó khăn, đồng thời ra mắt nhiều tiết mục, vở diễn phục vụ đồng bào, chiến sĩ Thủ đô, góp phần bảo vệ, giải phóng đất nước. Những vở rối đầu tiên được Đoàn xây dựng gồm “Mở đường”, “Tý Béo và Cao Kều”, “Con Mèo Lười”, “Bé Đất và Quỷ Đá”, “Con voi ác”, “Thỏ và Rùa”…
Diễn viên các thế hệ trong vở "Tấm Cám".
Năm 1975, Đoàn Nghệ thuật Kim Đồng đổi tên thành Đoàn múa rối Hà Nội. Thời kỳ này, có rất nhiều nhạc sĩ, họa sĩ tài danh đã cộng tác với Đoàn trong việc xây dựng các tiết mục, vở mới như nhà văn Tô Hoài, các họa sĩ Vũ Đình Thịnh, Hoài Giao, Tạ Vũ, Đình Quý, các nhà văn Lưu Quang Thuận, Nguyễn Thành, các đạo diễn Trần Hoạt, Trần Nghĩa, Cao Kim Điển, các nhạc sĩ Văn Cao, Hoàng Vân, Nguyễn Văn Tý, Cao Việt Bách, Đặng Hữu Phúc…, các họa sĩ Ngô Mạnh Lân, Mai Long, Nguyễn Đức Nùng, Nguyễn Hồng, Trần Chắt, Bùi Huy Hiếu…
Tháng 8-2001, UBND TP Hà Nội đã đổi tên Đoàn múa rối Hà Nội thành Nhà hát múa rối Thăng Long, và Nhà hát kể từ đây cũng có trụ sở chính thức tại địa chỉ 57 Đinh Tiên Hoàng, Hà Nội với rạp diễn và thủy đình, sân khấu riêng. Không chỉ xây dựng và biểu diễn rối cạn, rối nước, Nhà hát vẫn duy trì biểu diễn các chương trình rối cổ truyền thống phục vụ khán giả. Tên tuổi của Nhà hát đã được bạn bè quốc tế biết đến, tiếng vang đã lan tỏa khắp thế giới.
50 năm qua, Nhà hát múa rối Thăng Long cũng đã gặt hái được nhiều thành tích với rất nhiều HCV, HCB, bằng khen cho các cá nhân và tập thế tại các Liên hoan nghệ thuật, cuộc thi trong và ngoài nước. Năm 2011, Nhà hát được Thủ tướng Chính phủ tặng Bằng khen cho những thành tích xuất sắc từ năm 2008 đến năm 2010. Đặc biệt, năm 2013, Nhà hát được Chủ tịch nước trao tặng Huân chương Lao động Hạng Nhất.