Trên đường đến Hội nghị đồng chí đã cải trang, vượt qua sự kiểm soát gắt gao của kẻ thù. Tại Hội nghị này, Đảng ta chủ trương phát động nhân dân toàn miền nam đứng lên thực hiện đấu tranh chính trị kết hợp với đấu tranh vũ trang, giành quyền làm chủ, phá thế kìm kẹp của địch ở từng địa phương. Chủ trương trên đã cho đánh, tuy bản thân rất mừng, nhưng đồng chí không khỏi băn khoăn trong hoàn cảnh Bến Tre chưa có lực lượng vũ trang, làm sao xây dựng được lực lượng vũ trang để hỗ trợ đắc lực cho phong trào chính trị nổi dậy phá thế kìm kẹp, giải phóng thôn, ấp thắng lợi. Ngày 30-12-1959, khi đồng chí Nguyễn Thị Định về tới Mỏ Cày thì mới biết địch vừa càn qua đây, cơ sở và các đồng chí lãnh đạo chủ chốt của tỉnh, người thì bị địch giết hại, người thì cùng cơ sở di chuyển đi chỗ khác, không biết hiện ở đâu. Trước tình hình đó, thay mặt Tỉnh ủy, đồng chí Nguyễn Thị Định quyết định triệu tập Hội nghị các cán bộ lãnh đạo chủ chốt còn lại trong tỉnh (đồng chí Bí thư Tỉnh ủy đi công tác vắng) họp tại Cù lao Minh để truyền đạt tinh thần Nghị quyết 15 và thống nhất triển khai hành động. Nếu chờ tập hợp được đông đủ Ban lãnh đạo, chắc chắn ta sẽ bị lỡ mất thời cơ, sẽ bị chậm trễ.
Trước mắt, đồng chí Nguyễn Thị Định và các đồng chí sẽ phải giải quyết nhiều khó khăn cùng một lúc như triển khai thực hiện chủ trương của trên trong khoảng thời gian gấp và thiếu nhiều cán bộ cốt cán của tỉnh. Một khó khăn nữa là ta chưa có lực lượng vũ trang, không có súng, còn kẻ thù thì quỷ quyệt, lại được trang bị vũ khí đầy đủ và hiện đại. Nhưng đồng chí tin vào chủ trương đúng đắn của Đảng, tin vào sức mạnh đoàn kết của đồng bào, đó là những nhân tố bảo đảm cho thắng lợi trong cuộc đấu tranh sắp tới.
Trên cơ sở phân tích những thuận lợi và lượng định cả khó khăn, Hội nghị quyết định phát động một tuần lễ toàn dân đồng khởi diệt ác ôn, phá kìm kẹp, tạo thế bất ngờ làm cho địch trở tay không kịp, dùng bạo lực chính trị tiến công dồn dập và mãnh liệt vào khâu yếu nhất của địch là chính quyền cơ sở ở nông thôn, giải phóng nông thôn. Tùy theo tình hình từng địa phương mà lãnh đạo quần chúng nổi dậy, nhưng tất cả phải sẵn sàng chi viện cho nhau. Đồng thời, Hội nghị cũng quyết định lấy Cù lao Minh gồm ba huyện Minh Tân, Mỏ Cày, Thạnh Phú làm điểm nổi dậy trước tiên. Điểm chính là Mỏ Cày với ba xã Định Thủy, Bình Khánh, Phước Hiệp, nơi có cơ sở chính trị quần chúng khá mạnh.
Quán triệt tinh thần của Hội nghị, sau một quá trình gấp rút chuẩn bị, ngày 17-1-1960, các tổ vũ trang của ta đã tiêu diệt tên ác ôn Đội Tý và thực hiện thành công trận đánh diệt Tổng đoàn dân vệ, mở màn cho cuộc đồng khởi của Bến Tre. Quần chúng nhân dân ở Định Thủy, Bình Khánh, Phước Hiệp được các tổ vũ trang hỗ trợ nhất tề nổi dậy giải phóng xã và đồn Định Thủy, thu hơn 30 khẩu súng các loại. Ngay trong ngày đầu đồng khởi giành thắng lợi, thu được nhiều súng, chị Ba Định chỉ đạo gửi ngay một số súng sang hai huyện Minh Tân và Thạnh Phú cùng với tin thắng trận để khuếch trương ảnh hưởng, tạo đà cho phong trào hai nơi nổi dậy. Tới đêm cùng ngày, đồng bào dưới sự chỉ đạo của Đảng bộ địa phương tiếp tục giải phóng hai xã còn lại.
Qua một tuần, quân và dân ta đã giải phóng hoàn toàn gần chục xã và một số ấp, diệt nhiều tên ác ôn sừng sỏ, khét tiếng có nhiều nợ máu với nhân dân, phá thế kìm kẹp ở nhiều vùng rộng lớn.
Phát huy thắng lợi, chị Ba Định cùng các đồng chí lãnh đạo trong tỉnh Bến Tre quyết tâm chỉ đạo đẩy nhanh việc xây dựng lực lượng vũ trang chính quy của tỉnh, sử dụng lực lượng này kết hợp với cơ sở nội tuyến lấy đồn địch; tập trung lực lượng cán bộ về xây dựng các đoàn thể, gây dựng phong trào, xây dựng tới đâu trấn áp phản cách mạng tới đó, giao cho quần chúng tự quản, lấy thanh niên làm nòng cốt, giải tán tề ấp, trừng trị ác ôn, chia lại ruộng đất cho nhân dân, chuẩn bị chiến đấu chống địch càn quét khủng bố.
Trong những ngày khói lửa chiến tranh và vây giáp của kẻ thù, trước thử thách sống còn, làm sao chống được giặc, bảo vệ được thành quả và phong trào cách mạng vừa mới giành được, là người đứng mũi chịu sào, chèo lái phong trào cách mạng, chị Ba Định đã không hề nao núng tinh thần cùng với Ban lãnh đạo đồng khởi họp bàn cách chống trả địch; tập trung tất cả cán bộ, kiên quyết lãnh đạo nhân dân chống càn, bám đất, giữ vững phong trào, nắm chắc lực lượng, chọn chỗ hiểm của địch đánh thật mạnh; đấu tranh không cho chúng bắn giết, cướp bóc, vận động phân hóa hàng ngũ binh lính địch.
Theo chủ trương trên, quân và dân ta ở ba xã đã đoàn kết một lòng chiến đấu quyết liệt, lợi dụng địa hình chống trả lại quân địch, đồng thời thực hiện các hoạt động nghi binh, phao tin quân chủ lực ta sắp đánh về khiến địch mắc mưu rút quân, ta diệt khoảng 200 tên địch, thu nhiều vũ khí. Nhưng địch vẫn để lại một bộ phận lực lượng lớn đóng quân ở xã Phước Hiệp nhằm khống chế, kìm kẹp đồng bào ta. Chúng đã gây ra nhiều tội ác dã man, ảnh hưởng lớn tới phong trào cách mạng. Được sự nhất trí của Khu ủy, chị Ba Định quyết định tổ chức ngay một lực lượng đông đảo chị em phụ nữ xông thẳng vào quận Mỏ Cày tố cáo tội ác của địch ở Phước Hiệp. Cuộc đấu tranh chính trị của đội quân tóc dài lúc cao điểm đã lên tới 5.000 người với nhiều lứa tuổi, được nhân dân trong toàn huyện giúp đỡ tận tình, diễn ra giằng co, quyết liệt kéo dài gần 10 ngày với biết bao gian khổ và cuối cùng đã giành thắng lợi. Bọn địch đã phải ra lệnh thả một số chị em bị bắt, rút lực lượng thủy quân lục chiến. Cuộc càn quét quy mô lớn của địch đã hoàn toàn thất bại.
Đồng chí Nguyễn Thị Định, một phụ nữ kiên cường, vượt lên hiểm nghèo, hoàn thành xuất sắc nhiệm vụ, đoàn kết được cán bộ, chiến sĩ, tích cực góp phần vào thắng lợi chung. Tại Hội nghị Tỉnh ủy Bến Tre cuối tháng 5-1960, chị được tín nhiệm bầu làm Bí thư Tỉnh ủy khi tuổi đời vừa tròn 40.
Phong trào đồng khởi ở Bến Tre là một trong những phong trào tiêu biểu nổi dậy khởi nghĩa từng phần, phá thế kìm kẹp của kẻ thù, giành quyền làm chủ ở các địa phương.
